CRISPR-Cas12a系统因其高特异性和高效切割活性，已成为分子诊断领域的重要工具。然而，其在检测非核酸靶标（如酶、蛋白质等）时，通常需要多步识别和转化过程将靶标转化为核酸模拟靶标，过程复杂、成本高且耗时。近期，重点实验室卓颖教授团队在《Angewandte Chemie-International Edition》上在线发表了题为“Allosteric Activation of Cas12a via PAM Topological Engineering for Direct and Rapid Detection of Nucleases”的热点研究论文（Hot Paper）。提出了一种通过邻近间隔区基序（PAM）拓扑工程策略，实现了对Cas12a活性的精准调控，并成功用于多种核酸酶的直接、快速检测。

具体而言，该研究团队通过将PAM序列分裂并嵌入三叉连接中心，设计了一种含有Cas12a激活子序列的Y形DNA结构（Y-COPE）。这种精心设计的拓扑结构有效阻断Cas12a对PAM的识别，从而抑制其活性。当目标核酸酶识别切割特定位点后，释放DNA片段并动态修复PAM的双链结构，从而激活Cas12a并触发信号输出。

首先，通过合理设计一系列Y-COPE变体（Y1–Y6），逐步将PAM（5′-TTTA-3′）从分支远端移至茎部近端，研究发现Y3变体对Cas12a的抑制效果最强。凝胶电泳（PAGE）和荧光分析结果高度相关（Pearson’s r = 0.9279），证实PAM拓扑结构对Cas12a活性具有可靠有效的调控作用。

通过结构建模和理论结合能分析计算发现，Y-COPE与Cas12a RNP的结合自由能比经典dsDNA激活子高24.2 kcal/mol，且PAM与Cas12a蛋白PI结构域中关键残基Lys595之间的中心距离增加了1.8 Å，从机制上揭示了PAM拓扑结构抑制Cas12a活性的作用机制。

最后，作为概念验证，该团队成功构建了用于尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）和核糖核酸酶H（RNase H）检测的功能化Y-COPE变体。UDG检测限达2.69×10^–5 U/μL，RNase H检测限低至2.55×10^–7U/μL，且在复杂生物基质中检测性能优良，显示出高的特异性和抗干扰能力。